Jak edycja genów wpływa na kolor umaszczenia i tolerancję na ciepło

Nauki genetyczne wciąż potrafią zadziwić. Niedawno stwierdzono, że edycja genomu jest cennym narzędziem do rozjaśniania koloru sierści, aby lepiej dostosować bydło mleczne do szybko zmieniających się warunków klimatycznych i jednocześnie zapobiegać skutkom stresu cieplnego.

tekst: Mateusz Uciński Na podstawie: G. Laible, S.-A. Cole, B. Brophy, J. Wei, S. Leath, S. Jivanji, M. D. Littlejohn & D. N. Wells, Holstein Friesian dairy cattle edited for diluted coat color as a potential adaptation to climate change

Wspomnianego odkrycia dokonali badacze z Centrum AgResearch w Nowej Zelandii. Zaobserwowali oni, że wysokowydajne bydło mleczne rasy holsztyńsko‑fryzyjskiej ma charakterystyczną czarno-białą sierść, często z dużymi proporcjami czarnego umaszczenia. W porównaniu z jasną sierścią czarna pochłania zdecydowanie więcej promieniowania słonecznego, co – jak nietrudno się domyślić – przekłada się na nagrzewanie zwierzęcia. To z kolei jest czynnikiem sprzyjającym występowaniu stresu cieplnego u bydła, negatywnie wpływającego na poziom jego produkcji mlecznej, płodność i dobrostan.

Prace nad edycją genomu miały na celu działania na genie premelanosomalnego białka 17 (PMEL). Jest to białko błonowe, które ulega ekspresji wyłącznie w komórkach pigmentowanych, gdzie bierze udział w dojrzewaniu melanosomów oraz w odkładaniu i polimeryzacji pigmentu w tych organellach. Mutacje w PMEL są związane z rozcieńczeniem czarnego pigmentu u kilku gatunków, ale występują w różnych częściach białka.

Badanie wykazało, że u różnych gatunków krów mutacje białka PMEL są odpowiedzialne za efekty rozcieńczenia kolorów. Naukowcy stwierdzili, że delecja kodonu leucyny w peptydzie sygnałowym (p.Leu18del) segregacji PMEL u bydła rasy highland, galloway i tuli została zaproponowana jako mutacja sprawcza dla efektów koloru sierści. Uznali, że chociaż rola tego wariantu nie została funkcjonalnie potwierdzona, to proponowany wpływ koloru sierści czyni go doskonałym kandydatem do introgresji u bydła mlecznego rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w celu zmniejszenia promieniowania cieplnego i poprawy ogólnej tolerancji na ciepło.

Edytowane cielęta
Nowozelandzcy uczeni w trakcie eksperymentów zastosowali introgresję za pośrednictwem gRNA/Cas9 – czyli naturalnie występującej mutacji p.Leu18del w genie PMEL (znanej u bydła galloway i highland) – u bydła rasy holsztyńsko‑fryzyjskiej. Wykorzystując edycję za pośrednictwem gRNA/Cas9, wprowadzili delecję trzech par zasad w genie PMEL, zaproponowanym jako wariant sprawczy odpowiedzialny za półdominujący fenotyp rozcieńczenia koloru, obserwowany u wspomnianego wcześniej bydła rasy galloway i highland.

Aby określić fenotypowy wpływ mutacji PMEL, wykorzystali transfer jądra komórki somatycznej do wygenerowania cieląt z komórkami dawcy z biallelicznego klonu CC14 i rodzicielskiej linii komórkowej WT BEF2. Po przeniesieniu zrekonstruowanych zarodków w 37. dniu ciąży wykryto łącznie siedem ciąż. Dla każdego genotypu jedna ciąża nie powiodła się, w wyniku czego urodziło się dwoje cieląt zmutowanych białkiem PMEL i troje cieląt kontrolnych. Po narodzinach dwojga cieląt zespół potwierdził, że fragmenty, które powinny być koloru czarnego, były srebrzystoszare – a białe obszary pozostały nienaruszone.

Ubarwienie
Cielęta wygenerowane z komórek homozygotycznych pod względem edytowanej mutacji wykazały silny efekt rozcieńczenia koloru. Zamiast charakterystycznego czarno-białego wzoru cieląt kontrolnych, urodzonych z nieedytowanych komórek rodzicielskich, poddane edycji genetycznej osobniki wykazywały nowy wzór szaro-białych znaczeń i brak jakichkolwiek czarnych obszarów. Zweryfikowało to przyczynowy charakter mutacji PMEL dla osłabienia czarnej maści u bydła holsztyńskiego.

Cielęta homozygotyczne pod względem mutacji PMEL wykazywały wyraźne rozcieńczenie koloru do srebrzystoszarego, w przeciwieństwie do czarnej sierści u cieląt kontrolnych. Naukowcy wykorzystali metodę klonowania do stworzenia zarodków przeznaczonych do modyfikacji genetycznej i zastosowali mediację gRNA/Cas9 (narzędzie CRISPR), aby zmutować gen PMEL. Po siedmiu dniach hodowli metodą in vitro pojedyncze zarodki zostały bezoperacyjnie przeniesione do zsynchronizowanych krów biorczyń w celu rozwoju. Warto wyjaśnić, że wspomniany wcześniej CRISPR (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to system obrony organizmów prokariotycznych (bakterii i archeonów) przed egzogennymi elementami genetycznymi (np. bakteriofagami czy plazmidami). System ten opiera się na przechowywaniu w genomie fragmentów „obcego” (egzogennego) DNA, pozyskiwanego np. w trakcie infekcji wirusowej, aby możliwe było w przyszłości wykrycie takiej sekwencji – czemu towarzyszyć będzie zniszczenie (za sprawą enzymów tnących nić DNA, czyli nukleaz) obcego elementu genetycznego. System CRISPR jest obecnie wykorzystywany w biotechnologii do celowego modyfikowania genomu (edycja genów) w precyzyjnie wybranych miejscach.

Na podstawie tego eksperymentu uczeni z AgResearch stwierdzili również, że istnieje nie tylko ogólne rozmycie koloru czarnych plam, ale także widoczna jest wyraźna różnica w rozmieszczeniu i wzorach ciemnych i białych łat. Cielę ze zmutowanym genem PMEL miało większą całkowitą powierzchnię białych znaczeń i charakterystyczny biały pysk, w przeciwieństwie do cieląt kontrolnych, które były głównie koloru czarnego, miały czarny pysk i biały romb na czole.

W celu ilościowego określenia efektu rozcieńczenia koloru spowodowanego mutacją PMEL wykonano pomiary kolorymetryczne włosów i skóry pod sierścią u trojga cieląt kontrolnych i u cielęcia PMEL. Wyznacznikiem była jasność koloru wyrażona jako wartość L, zgodnie ze schematem kolorów CIELab, który definiuje jasność bieli jako sto, a czerni jako zero. Odcień białej sierści cielęcia PMEL był podobny do koloru sierści cieląt kontrolnych. Natomiast odcień ciemnych włosów miał wyższą wartość jasności dla cielęcia PMEL (L = 53,8) w porównaniu z włosami trojga cieląt kontrolnych (L* = 16,8, 20,5 i 16,5). Aby ocenić wszelkie powiązane zmiany w pigmentacji skóry pod spodem, zmierzono jasność skóry poniżej białych i ciemnowłosych oznaczeń sierści. Kolor skóry pod włosami był podobny do koloru włosów.

Obawy o bezpieczeństwo, identyfikowalność i etykę
Badania pokazują, że ocena bezpieczeństwa i identyfikowalności produktów pochodzących od bydła transgenicznego i bydła poddanego edycji genetycznej może być skomplikowana. W jednym badaniu naukowcy z Uniwersytetu Wageningen stwierdzili dwa główne ograniczenia edycji genów. Po pierwsze, ponieważ modyfikacje nie muszą być wielkie, może nie być możliwe odróżnienie tych zmian genetycznych od podobnych zmian w genomach zwierzęcych, które mogą zachodzić naturalnie w naturze. Po drugie, ponieważ zwierzęta te nie muszą podlegać systemom zatwierdzania w różnych częściach świata, szczegóły modyfikacji genetycznych mogą nie być udostępniane we wspólnych bazach danych, co poważnie utrudnia możliwości skutecznego śledzenia odpowiednich linii i ras zwierząt oraz pokrewnych produktów w innych krajach, w których identyfikowalność byłaby wymagana. Uczeni dodali, że oprócz kwestii etycznych inżynieria genetyczna niesie ze sobą obawy o własność intelektualną i patentowanie stworzonych zwierząt i/lub technik stosowanych do ich tworzenia.

Według naukowców wykorzystujących edycję genomu do rozjaśnienia koloru włosów i sierści jest to pierwszy przykład, który funkcjonalnie potwierdził przyczynowy status mutacji fenotypu koloru sierści u bydła. Ich zdaniem edytowany genotyp stanowi teraz cenny model do badania wpływu koloru sierści na tolerancję na ciepło i do określania wszelkich potencjalnych skutków, które mogą mieć wpływ na wydajność rozrodczą, charakterystykę produkcji mleka i odporność na choroby związane z ekspozycją na światło słoneczne. Uczeni uważają, że badanie potwierdziło edycję genomu jako obiecującą nową metodę szybkiej adaptacji zwierząt gospodarskich do zmieniających się warunków środowiskowych. 