Antybiotyki w mleku zbiornikowym cz. 2.

Obecność substancji hamujących w mleku ponad dopuszczalne normy wiąże się z poważnymi konsekwencjami finansowymi dla dostawcy. Kłopoty mogą wynikać nie tylko z zaniedbań producenta mleka. Jak zatem ich uniknąć?

TEKST: DR SEBASTIAN SMULSKI, UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W POZNANIU; ZDJĘCIA: SEBASTIAN SMULSKI, ARCHIWUM SGGW

Kontynuując temat substancji hamujących w mleku, rozpoczęty w wydaniu 1/2018, w niniejszym artykule omówię wybrane testy przeznaczone głównie do oceny obecności antybiotyków w mleku zbiornikowym. Dzięki poznaniu mechanizmów ich działania można zrozumieć powstawanie wyników nieprawdziwych.

Metody wykrywania substancji hamujących

Rycina 1. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Należy zacząć od następującej informacji: nie istnieją laboratoria ani testy, które umożliwiają oznaczenie wszystkich dostępnych substancji hamujących (w tym antybiotyków). Każda szukana substancja hamująca wymaga osobnych, złożonych metod diagnostycznych. Nie ma, niestety, uniwersalnych testów. Obecność substancji hamujących w mleku można oznaczać dwiema metodami: ilościowo i jakościowo. Metody ilościowe są czaso- i kosztochłonne. Mogą być wykonywane tylko w specjalnych miejscach (np. wyższe uczelnie, Państwowy Instytut Weterynaryjny). Do wykonania takich oznaczeń potrzebne są specjalistyczne urządzenia, np. wysokosprawna chromatografia cieczowa w połączeniu ze spektrofotometrią mas, które pozwalają uzyskać wynik w postaci konkretnej cyfry, np. 50 ppm (part per milion). Taką aparaturę przedstawia rycina 1. Umożliwia ona z dużą dokładnością oznaczenie stężenia badanego związku w mleku. Uzyskany wynik można porównać z wytycznymi UE (omawianymi w poprzedniej części) i odpowiedzieć na pytanie, czy wartość badanej substancji hamującej przekroczyła wartość MRL (tj. najwyższe dopuszczalne stężenie pozostałości), czy też nie. Tylko taka metoda jest w 100% pewna. Czas oczekiwania na wynik z reguły przekracza jeden tydzień, a koszt jest kilkaset razy wyższy (w zależności od użytej metody) w porównaniu do popularnie używanych testów. Zaprezentowana metoda wyklucza przydatność tego typu badań w rutynowej ocenie mleka w laboratoriach mleczarnianych. Zgodnie z literą prawa tylko ilościowa metoda oznaczenia poziomu substancji hamujących jest zgodna z obowiązującym prawem i powinna być jedyną formą rozstrzygania sporów między zakładem mleczarskim a producentem mleka.

Rodzaje testów
Zdecydowanie bardziej popularne, choćby ze względu na szybkość uzyskiwanego wyniku czy cenę jednostkową badania, są testy wykorzystujące metody jakościowe. Otrzymany wynik jest pozytywny, negatywny, ewentualnie wątpliwy. Testy używane są powszechnie przez laboratoria badające mleko, lekarzy weterynarii czy producentów mleka. Omawiane komercyjne testy wykorzystują trzy różne metody oznaczeń:
• mikrobiologiczne,
• enzymatyczne,
• immunoenzymatyczne (receptorowe).

Testy mikrobiologiczne oparte są na zjawisku hamowania wzrostu szczepu testowego bakterii (np. Bacillus subtilis, Bacillus stearotermophilus) w obecności substancji hamujących. Wymienione testy jakościowe są powszechnie używane do oznaczania pozostałości antybiotyków w mleku przez laboratoria sprawujące nadzór nad jakością mleka, lecz czułość wykrywania antybiotyku może znacznie odbiegać od wartości MRL (tj. najwyższego dopuszczalnego stężenia pozostałości). Liczba dostępnych testów komercyjnych nieustannie rośnie. Każdy test, który jest dopuszczony do obrotu, powinien posiadać pozytywną opinię krajowego laboratorium referencyjnego, którym jest Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach. Testy mikrobiologiczne używane na naszym rynku to np: Delvotest SP, Eclipse, BR-test, Polutest.

Rycina 2. Możliwe wyniki Delvotestu

Spośród testów mikrobiologicznych najpopularniejszym jest Delvotest SP. Jest to test ampułkowy. Do probówki zawierającej szczepy testowe bakterii i specjalne podłoże mikrobiologiczne dodajemy próbkę mleka testowego. Całość inkubujemy w 64°C (±2°C) przez 3 godziny. Efektem końcowym jest reakcja barwna, przedstawiona na rycinie 2. Wynik dodatni otrzymujemy tam, gdzie kolor roztworu pozostanie bez zmian (fioletowy). Z kolei zmiana koloru z fioletowego na żółty świadczy o tym, że w badanej próbce nie było obecności substancji hamujących (np. antybiotyku) i doszło do rozwoju hodowli bakterii znajdujących się w teście, zakwaszenia środowiska. Test wykrywa większość antybiotyków, a zwłaszcza penicylinę. Charakteryzuje się często wyższą czułością niż wskazane progi MRL (tj. najwyższe dopuszczalne stężenia pozostałości).

Rycina 3. Schemat testu typu Charm

Testy oparte na mechanizmach receptorowych (antybiotyk – receptor na pasku bibułkowym) pozwalają uzyskać wynik w krótkim czasie (kilka minut) i są ukierunkowane na konkretne grupy antybiotyków. Wśród testów receptorowych powszechnymi są testy typu Charm (Rosa Milk, SL, MRL, MRLBL1, β-lactam/Tetra, Chlor, Enro itd.). W zależności od rodzaju testu możemy wykrywać obecność: β-laktamów, aminoglikozydów, enrofloksacyny, makrolidów, novobiocyny, sulfonamidów i tetracyklin. Metodyka wykonania oznaczenia jest bardzo prosta. Trzysta µl mleka umieszczamy w specjalnym oznaczonym miejscu na teście (studzienka/dołek) oraz inkubujemy w temperaturze 56±1°C przez 8 minut (np. Charm MRL BL/TET). Próg wykrywania antybiotyków jest zbliżony do wartości MRL. Odczyt wyniku również jest bardzo prosty, co obrazuje rycina 3.

 

Wymienione wyżej testy przeznaczone są do badania mleka zbiorczego (w schładzalniku). Używanie ich do badania mleka krowiego (z 4 ćwiartek tej samej krowy) jest metodą pośrednią. Niektórzy autorzy podpowiadają, że z pełnym powodzeniem można pobraną (badaną) próbkę rozcieńczyć w mleku zbiorczym w stosunku 1:4. Takie rozcieńczenie i tak jest zdecydowanie mniejsze, niż rozcieńczenie mleka danej krowy w surowcu od wszystkich krów w stadzie, który zmagazynowano w schładzalniku.

Wyniki fałszywie dodatnie i ujemne
Żadna metoda obliczania okresu karencji nie zapewni, że 100% zwierząt będzie wolnych od pozostałości po upływie okresu karencji podanego w ulotce antybiotyku. Szczegóły opisuje wytyczna UE, przedstawiająca zasady obliczania okresów karencji dla mleka, która zakłada limit 95% pewności w odniesieniu do 95% populacji badanych krów. Całość interpretacji komplikują wyniki fałszywie dodatnie i ujemne. Przyczyny wyników fałszywie dodatnich – czyli takich, gdzie zawartość antybiotyku jest poniżej progu MRL (tj. najwyższego dopuszczalnego stężenia pozostałości), a wynik testu jest dodatni – mogą być dwojakie. Na taki wynik wpływa obecność naturalnych inhibitorów wzrostu drobnoustrojów zawartych w mleku (lizozym, laktoperokydaza, laktoferyna itd.). Ich ilość wzrasta wraz z natężeniem procesu zapalnego (liczbą komórek somatycznych – LKS).

Opiszę to na przykładzie. Zakładamy, że krowa jest po okresie karencji i badany antybiotyk faktycznie znajduje się w mleku w stężeniu niższym od MRL (tj. najwyższego dopuszczalnego stężenia pozostałości). Wysoka LKS sugeruje, że w tejże próbce znajdą się również wspomniane naturalne substancje inhibitorowe. Niskie stężenie antybiotyku sumuje się z działem naturalnych substancji inhibitorowych i otrzymany wynik może być dodatni. Przedstawiona sytuacja odnosi się głównie do testów mikrobiologicznych. Kilkugodzinna inkubacja ma na celu neutralizację naturalnych inhibitorów, lecz proces ten nie zachodzi w 100%.

Kolejną przyczyną uzyskania wyników fałszywie dodatnich jest zbyt wysoka czułość testów w stosunku do wartości MR (tj. najwyższego dopuszczalnego stężenia pozostałości). Sytuację ilustruje tabela 1. Wynika z niej wyraźnie, że wiele testów wykazuje zbyt wysoką czułość w porównaniu do ustalonej wartości MRL (gwiazdka – *). W przypadku penicylin czułość testów może być nawet do 50% wyższa od wymaganej (Delvotest). Z kolei czułość niektórych testów wobec choćby ceftiofuru i streptomycyny może okazać się zbyt niska (Delvotest, Beta Star) i dać wyniki fałszywie ujemne, czyli sytuację, gdzie stężenie antybiotyku przekracza wartości MRL (tj. najwyższego dopuszczalnego stężenia pozostałości), a otrzymany wynik testu jest ujemny. W razie podjęcia decyzji o wprowadzeniu testów na obecność substancji hamujących do obory najbezpieczniejszym rozwiązaniem wydaje się być stosowanie takiego samego testu, jakiego używa nadzorujące laboratorium mleczarniane lub zbadanie mleka bezpośrednio w laboratorium odbiorcy białego surowca.

Jak spełnić normy o pozostałościach substancji hamujących?
Najistotniejszym elementem zapobiegającym pojawianiu się pozostałości antybiotyków jest stosowanie antybiotyków zgodnie z zaleceniem producenta (liczba podań i okres karencji). Stosując jakiekolwiek modyfikacje w leczeniu (np. stosowanie terapii złożonych, dowymieniowych i ogólnych, wydłużonych, itd.), powinno się przyjąć ulotkowy okres karencji i następnego dnia mleko powinno być poddane badaniu u odbiorcy tego surowca. Każde inne podejście naraża producenta mleka na konsekwencje. Usuwanie mleka tylko z jednej leczonej ćwiartki i dojenie pozostałych ćwiartek jest kategorycznym i niestety powszechnym błędem, zabronionym przez prawo i powielanym przez farmerów. Ponadto warto stosować się do następujących zaleceń:
• skrupulatnie notować wszystkie terminy użycia antybiotyków,
• utrzymywać osobno krowy w okresie zasuszenia i laktacji,
• nie oddawać do mleczarni mleka przez 4 dni po wycieleniu,
• używać osobnych urządzeń udojowych dla mleka będącego w karencji,
• badać krowy świeżo zakupione na obecność substancji hamujących,
• korzystać z pomocy specjalistów.

Produkcja mleka spełniającego normy w zakresie zawartości substancji hamujących nie jest trudnym zadaniem, ale wymaga przestrzegania wyżej wymienionych zasad.